<형광단백질을 이용한 실시간 small GTPase 단백질 센서의 개발과 생명연구의 적용 >

(a) Schematic of ddFP-based small GTPase sensor. (b) (top) Schematic depiction of KRas (G-KRas) sensor construct. (bottom) Fluorescence images showing Ras activity during sequential treatment of EGF (50 ng ml^-1) and EGFR inhibitor, gefitinib (400 nM). (c) Simultaneous imaging of HRas and Rac1 activities in MDA-MB-231 cell co-expressing R-HRas, G-Rac1, and Lyn-miRFP. Fluorescence ratio images showing Ras and Rac1 activity during cell migration. (d) Schematic of Ras activation by blue light-mediated optoFGFR1 activation. (e) Visualization of local activation of HRas by OptoFGFR1. Light stimulation was applied to the peripheral region (indicated by red circle) of an MDA-MB-231 cell co-expressing R-HRas and optoFGFR1. Images showing local increase of Ras activity and membrane protrusion. All scale bars, 20 mm. (f) Schematics of virus injection and two-photon microscopy in mice running on a spherical treadmill. (g) Time-lapse in vivo two-photon imaging of G-HRas activity in the awake state. Arrow indicates example Ras signal punctum that shows fluorescence intensity increases. Scale bar, 2 μm. Images or quantified data are representatives of multiple experiments (N > 3).

1. 배경지식

   형광 단백질의 발견 및 개발은 세포 내 단백질 활동의 동적 변화를 추적하는 기술에 크게 기여해 왔습니다. 특히, 세포 내 항상성이 유지되어 있는 상태에서 단일 단백질의 기능을 관찰 할 수 있어 의미를 가지며, 질병연구에서 비정상적인 신호전달과정을 추적 할 수 있어 중요합니다. Ras 및 Rho small GTPase는 세포 분열, 이동 등 다양한 세포 과정에 기여합니다. 이러한 단백질의 시공간적 활동을 시각화 하기위한 광범위한 노력에도 불구하고, 생체 내 적용에 필요한 감도와 동적 범위를 보유하는 바이오센서의 개발은 제한적이었습니다. 따라서 생체 내 단일 세포에서 여러 small GTPases의 활동을 시각화하고 고감도 성능을 보유한 intensiometric small GTPase 바이오 센서를 개발 하고자 도전하였습니다. 적색으로 개량된 바이오 센서는 청색광유전학 제어기술과 간섭없이 동시에 사용이 가능하다는 장점이 있으며 고도의 시공간적 단백질 활동을 조작하고 동시에 모니터링 할수 있습니다. 또한, 고감도 성능을 통해 Cdc42, Rac1 그리고 Ras small GTPase 단백질의 기능을 단일 수지상 돌기의 구조적 가소성 현상과 관련하여 해석 할 수 있었습니다. 이와 더불어 자유롭게 행동하는 생쥐의 뇌에서 다양한 세포 내 Ras 단백질의 활성을 최초로 관찰 하였습니다. 개발한 바이오센서는 생명체의 복잡한 신호 네트워크 상의 단일 단백질 기능을 시공간적으로 구획화 할 수 있었으며, 다양한 생명현상과 small GTPase 단백질 기능을 관련짓는 연구에 기여 할 것이라 기대 합니다.

2. 질문

   1) 개발한 센서가 동일한 small GTPase 단백질에 대해 기존 생화학적적 분석법과 비교하여 정량, 정성적 차이를 갖는지

       정확성 및 특이성 검증.

   2) 단일세포에서 동시에 여러 종류의 small GTPase 단백질을 서로 다른 파장으로(green or red) 관찰 가능한가.

   3) 적색계열 바이오센서 개발을 통해 청색광유전학(488nm) 기술과 접목될 수 는 유용성 확인.

   4) 살아있는 동물모델의 두꺼운 조직막을 통해 타겟 단백질의 활성을 관찰 할 수 있는 고감도 버전 개량.

3. 발견

   small GTPase 또는 다양한 세포내 단백질 활성 관찰을 위한 기존 바이오센서는 두 가지 형광 단백질을 사용하는FRET(Foster Resonance Energy Transfer) 이라는 기술에 대부분 국한되었습니다. 본 연구에서는 기존 기술과 달리 단일 형광을 이용한 개발로 다양한 장점을 확인 할 수 있었습니다. 특히 청색광유전학(optogenetics)과 같이 특정 파장 (488nm)을 활용하는 기술과 함께 용이하게 사용 할 수 있어 세포 이동과 같이 시공간적 구획화가 필요한 연구에 새로운 접근법을 제시 할 수 있었습니다. 개발과정에서 알게 된 pico수준의 예민한 감도 또한 두꺼운 조직막을 같는 동물모델 연구에 있어 유용함을 확인 할 수 있었습니다. 이외에도 녹색, 적색으로 센서를 개량 함으로써 단일세포에서 다수의 small GTPase 단백질 활성을 직접 비교분석 할 수 있었습니다. 특히 세포 마다 가지는 다양한 양상으로 야기 되는 실험적 오차를 극복 할 수 있고, 보다 세밀한 타이밍에서 단백질간의 상호작용을 비교 할 수 있어 신뢰성 높은 결과를 유도 할 수 있다고 기대 합니다. 또한, 고감도 성능을 통해 Cdc42, Rac1 그리고 Ras small GTPase 단백질의 기능을 단일 수지상 돌기의 구조적 가소성 현상과 관련하여 해석 할 수 있었습니다. 이와 더불어 자유롭게 행동하는 생쥐의 뇌에서 마이크로 크기의 공간에서 일어나는 Ras 단백질의 활성을 최초로 관찰 할 수 있었습니다. 종합하여, 개발한 바이오센서는 생명체의 복잡한 신호 네트워크 상의 단일 단백질 기능을 시공간적으로 구획화 할 수 있었으며, 다양한 생명현상과 small GTPase 단백질 기능을 관련 짓는 연구에 기여 할 것이라 기대 합니다.

4. 후속

   고감도 및 동물모 델 적용 가능성을 토대로 암세포전이연구, 신경세포발달 및 뇌신경회로 연구에 적용 기대. 기타 small GTPase 단백질 기능 및 질환 관련 연구그룹의 높은 활용 기대.

5. 소감

   새로운 기술은 기존 기술과의 엄밀한 비교를 요구합니다. 매번 기존 기술들과 비교 실험을 병행 해야 했던 점이 수고스러웠습니다. 기술이 가지는 장점을 보다 직관적으로 증명하기 위해 다양한 어플리케이션 실험을 시도하고 또 실패하며 힘들기도 했지만, 기존 기술보다 월등한 성능들을 매 순간 확인 할 수 있어 새로운 기술 개발에 한걸음씩 다가서는 희망을 가질 수 있었습니다. 또한, 소속 연구실에서 처음 시도 된 분야의 기술임에도 다양한 난관을 극복하고 도전했다는 점에서 새로운 연구주제에 대한 자신감을 얻는 계기가 되었습니다.

앞으로 많은 연구자들이 널리 이용 할 수 있는 생명과학분야의 유용한 분석기술이 되기를 희망합니다.

6. 기타

   물심양면 응원해주신 허원도 지도 교수님, 지칠 때 기쁠 때 함께 해 준 랩원 모두에게 감사 드립니다. 그리고 훌륭하게 연구를 마무리 할 수 있도록 Too Much John소리 해주신 이상규 박사님께 감사드립니다.