그림. 트랜스포존 시퀀싱 기법을 이용한 pyruvate transporter 유전자 기능 규명

 

1. 배경지식

    Pyruvate 은 생명체에서 탄소원으로부터 에너지를 얻는 과정인 Central carbon metabolism 에서 glycolysis 와 TCA cycle 의 중간 단계 물질로, 다양한 세포 내 대사 반응과 연결 되어있다. 따라서 이 pyruvate 는 E.coli 의 생장 과정 동안 세포 내 농도가 유동적으로 변화하고 조절된다. 그러나 E.coli 의 pyruvate 을 세포막 안팎으로 운반하는 pyruvate transporter system 에 대해서는 알려진 바가 많지 않다. 특히, pyruvate 의 농도에 따라 발현이 증가하는 inducible pyruvate transporter 유전자는 작년에 밝혀졌지만, 기존 연구에 따르면 2개 이상의 system 이 존재할 것으로 알려졌기 때문에 추가적인 연구가 요구되었다.

 

2. 질문

  E.coli genome 에서 Pyruvate transporter 를 encoding 하는 유전자를 찾아내고자 했다.

 

3. 발견

   해당 유전자를 찾아내기 위해, 유전체 상에 랜덤하게 삽입 되는 DNA 조각인 트랜스포존을 이용한 E.coli transposon library 를 이용했다. 해당 library 는 유전체 상에 존재하는 유전자가 한 개 씩 랜덤하게 기능을 못하게 된 것들의 모임이다. 이들을 3FP(3-fluoropyruvate) 라는 물질이 있는 배지에서 키웠는데, 3FP 는 toxic pyruvate analog 로 pyruvate transporter 에 의해 uptake 되어 세포를 죽이기 때문에 해당 물질이 포함된 배지에서 잘 자라는 clone 들 중에는 transporter 유전자에 트랜스포존이 삽입되었을 가능성이 크다는 논리를 이용했다. Enrich 된 transposon library 를 NGS (next-generation-sequencing) 을 통해 분석했고, 추가 biochemical assay 를 거쳐 2개의 유전자 (cstA, ybdD) 가 pyruvate transporter 유전자라는 것을 규명했다. 특히 이들은 세포 내 pyruvate 농도와 상관없이 발현되는 constitutive pyruvate transporter 로 보여졌다. 원래는 이들이 peptide transporter 기능을 한다고 알려져 있었는데, 이번 연구를 통해 pyruvate 도 transport 할 수 있다는 것을 밝혔다.

 

 

4. 후속

   왜 하필 peptide transporter 로 알려져 있던 것이 pyruvate 도 transport 하도록 되어있는지, 세포 생장 과정에서 여러 system 이 어떻게 맞물려 pyruvate 의 농도가 조절되는지 등 전체적인 이해가 부족하므로, 구체적인 cell physiology 에 관한 functional study 가 필요하다.

 

5. 소감

   비교적 간단하고 다루기 쉬운 대장균임에도 불구하고, massive 한 library 와data 를 다루기 때문에 실험 및 분석 과정이 순탄치 않았다. 특히, 실험 과정에서 계속 coccus 균으로 contamination 이 나서 다 때려치우고 싶었던 순간이 많았다. 그런 순간들을 계속 겪다 보니 조급한 마음을 먹을수록 더 실패할 확률이 높다는 사실을 몸소 깨달았다. 그래서 냉정하게 문제점을 해결할 수 있는 방법을 충분한 시간을 두고 찬찬히 생각하고, 머릿속에서 실험과 분석을 처음부터 끝까지 시뮬레이션을 돌려 본 후 진행하여 결국은 논문 제출까지 성공한 것 같다. 처음 SCI 저널에 논문을 submission 해 보니, 정말 연구가 쉽지 않다는 생각과 함께 어느 정도 성장한 느낌을 받아서 보람 있었다.

 

6. 기타

  지도해주신 교수님과 discussion 을 해준 동료들에게 감사합니다.