그림1. monSTIM1의 활성화 개념 그림설명(좌), 빛 세기에 대한 세포 내 칼슘 활성도(우)
그림2. 비침습적 광조사를 받고 있는 쥐 (좌), 빛 자극에 따른 칼슘 신호 마커, c-Fos발현 (우)
<빛의 민감도를
증가시킨 monSTIM1의 활성화를 통한 비침습적 뇌세포 칼슘 기능 활성화>
신경 생물학 연구에서 채널로돕신이라는 기술을 통해 그동안 밝히기 어려웠던 많은 신경 생물학적 질문들을 해결해 왔습니다. 그동안 세포 내부의 칼슘이라는 이온이 다양한 신호를 활성화 시키는데 중요하다고 알려져 왔지만, 기술적인 제한으로 인해 실시간적으로 많은 연구가 부족하였습니다. 광유전학 기술이 발달하면서 저희 연구실에서 옵토스팀원 (OptoSTIM1)이라는 기술을 개발하였고, 이 기술을 채널로돕신과 같이 더 많이 사용하게 하고자 더 기술적으로 발전시키고자 하였습니다. 특히나 인비보 모델에 적용하기 앞서 세포 내부에 과도하게 발현된 옵토스팀원은 기저 칼슘 레벨을 높여 생리적인 상황을 재현하는데 어려움이 있었습니다. 또한 신경 세포 내 칼슘을 연구하기 위해 부족한 빛의 민감도로 인해 항상 광섬유를 삽입하여 빛 자극을 가해 주었어야 했습니다. 이는 수술하는데 많은 시간이 소모될 뿐만 아니라, 외부 물질인 광섬유로 인해 조직 손상, 면역 반응 유발, 세포 모양 변화와 같은 한계점을 가지게 됩니다.
2. 질문
1) 옵토스팀원을 구성하고 있는 식물 단백질 CRY2의 변형을 통해 과발현에 의한 기저 칼슘을 낮출 수 있는가
2) CRY2의 유전자 조작을 통해 빛의 만감도를 향상시킬 수 있는가
3) 빛의 민감도가 증가하였을 때 비침습적으로 생체 모델에 적용할 수 있는가
3. 발견
본 연구에서 향상시킨 광유도 칼슘 조절 기술은 빛에 의해 다형체를 형성하는 식물 단백질 Cryptochrome2 (CRY2)의 구조적인 접근법을 통해 빛을 받지 않은 상태에서도 형성할 수 있는 이형체를 저해하는 유전자 변형을 유도하고자 하였습니다. 이미 구조적으로 알려져 있는 초파리의 CRY단백질이 이형체를 형성하며 또한 동형단백질인 CRY1단백질 또한 이형체를 이루는 것에 기초 하여 이형체를 형성할 수 있는 루프 구조의 아미노산을 치한하여 효과적으로 기저 칼슘 레벨을 낮출 수 있었습니다. 또한 빛에 의한 다형체 형성을 더 효과적으로 유도하는 기술인 CRY2clust (C말단의 추가적 9개 아미노산)을 함께 접목하였을 때, 빛의 민감도가 약 55배 가량 증가하였습니다. 아주 작은 빛인 1μW mm-2의 빛 세기에서도 효과적으로 세포 내 칼슘을 유입하는 이 시스템을 몬스팀원 (monster OptoSTIM1)이라 명명하였습니다. 몬스팀원을 쥐 뇌세포를 구성하는 흥분성 신경세포와 아교세포를 타겟팅하여 발현 시켰을 때 LED로 나오는 청색광만으로도 칼슘 하위 신호가 활성화가 되었습니다. 더 나아가 칼슘 관련 단백질들을 저해하였을 때 나타나던 공감 공포 저하 현상을 반대로 칼슘을 올려 주었을 때 효과적으로 공감 공포를 증가시키는 결과도 도출 하였습니다.
4. 후속
본 연구는 생체 모델에서 칼슘 활성을 비침습적으로 조절 가능하며, 특히나 장시간에 걸쳐 더 효과적으로 사용할 수 있다는 장점이 있습니다. 이를 더 광범위하고 편하게 사용될 수 있도록, 비침습적으로 세포 내에 발현을 시킬 수 있는 것 또한 가능할 것이라 기대합니다.
5. 소감
이 연구를 진행하면서 저희 연구실에서 처음으로 인비보 실험들을 진행했었습니다. 잘 모르는 분야에 있어서 배우고 숙련되기까지 시간이 꽤 걸렸지만 그 덕분에 기술의 장점을 아주 잘 살려 좋은 연구로 발전 시킬 수 있었습니다. 앞으로 개발된 기술을 이용하여 박사 후 과정 연구는 조금 더 질병과 연관하여서 연구에 이용하는 견문을 넓히고자 합니다.
6. 기타
이 연구를 하며 많은 지도와 아낌없는 지원을 해주신 허원도 교수님께 감사드립니다. 실험을 처음에 구상하고 발전하는 단계에 함께하고 학위 과정동안 많은 도움과 재미를 주신 이상규 박사님, 경태윤 박사님께 감사드립니다. 처음 인비보 연구하는데 있어 실험에 많은 도움을 주신 김대수 교수님, 김정은 박사님께 감사드립니다. 또한 뜻깊은 행동 연구로 공동 연구를 할 수 있는 기회를 주신 신희섭 단장님, 금세훈 박사님 그리고 박정준 선생님께도 감사드립니다. 항상 즐거운 실험실 하도록 해준 연구실 동료들도 너무 감사합니다. 학위 과정동안 옆에서 많이 응원해주었던 예지, 그리고 곁에서 많이 물심양면으로 많은 도움을 준 다른 연구실분들에게도 감사합니다. 끝으로 오랜 학위 기간동안 믿고 응원해주신 부모님과 가족들에게 감사 인사 전하며, 앞으로도 계속 좋은 연구로 인사드리도록 노력하겠습니다.
