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생명과학의 역사를 쓰는 사람들 Research Highlights

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인터뷰 김지훈
논문 Jihoon Kim*, Sangkyu Lee*, Kanghoon Jung*, Won Chan Oh, Nury Kim, Seungkyu Son, YoungJu Jo, Hyung-Bae Kwon & Won Do Heo (2019) Intensiometric biosensors visualize the activity of multiple small GTPases in vivo. Nature Communications, 10: 211 (*contributed equally). (https://doi.org/10.1038/s41467-018-08217-3)
한줄요약 신호전달계 중추적 역할을 담당하는 small GTPase 단백질의 활성을 생체 내에서 실시간으로 분석하기 위한 형광바이오센서 개발
그림1.png

<형광단백질을 이용한 실시간 small GTPase 단백질 센서의 개발과 생명연구의 적용 >

(a) Schematic of ddFP-based small GTPase sensor. (b) (top) Schematic depiction of KRas (G-KRas) sensor construct. (bottom) Fluorescence images showing Ras activity during sequential treatment of EGF (50 ng ml-1) and EGFR inhibitor, gefitinib (400 nM). (c) Simultaneous imaging of HRas and Rac1 activities in MDA-MB-231 cell co-expressing R-HRas, G-Rac1, and Lyn-miRFP. Fluorescence ratio images showing Ras and Rac1 activity during cell migration. (d) Schematic of Ras activation by blue light-mediated optoFGFR1 activation. (e) Visualization of local activation of HRas by OptoFGFR1. Light stimulation was applied to the peripheral region (indicated by red circle) of an MDA-MB-231 cell co-expressing R-HRas and optoFGFR1. Images showing local increase of Ras activity and membrane protrusion. All scale bars, 20 mm. (f) Schematics of virus injection and two-photon microscopy in mice running on a spherical treadmill. (g) Time-lapse in vivo two-photon imaging of G-HRas activity in the awake state. Arrow indicates example Ras signal punctum that shows fluorescence intensity increases. Scale bar, 2 μm. Images or quantified data are representatives of multiple experiments (N > 3).



1. 배경지식

   형광 단백질의 발견 개발은 세포 단백질 활동의 동적 변화를 추적하는 기술에 크게 기여해 왔습니다. 특히, 세포 항상성이 유지되어 있는 상태에서 단일 단백질의 기능을 관찰 있어 의미를 가지며, 질병연구에서 비정상적인 신호전달과정을 추적 있어 중요합니다. Ras Rho small GTPase 세포 분열, 이동 다양한 세포 과정에 기여합니다. 이러한 단백질의 시공간적 활동을 시각화 하기위한 광범위한 노력에도 불구하고, 생체 적용에 필요한 감도와 동적 범위를 보유하는 바이오센서의 개발은 제한적이었습니다. 따라서 생체 단일 세포에서 여러 small GTPases 활동을 시각화하고 고감도 성능을 보유한 intensiometric small GTPase 바이오 센서를 개발 하고자 도전하였습니다. 적색으로 개량된 바이오 센서는 청색광유전학 제어기술과 간섭없이 동시에 사용이 가능하다는 장점이 있으며 고도의 시공간적 단백질 활동을 조작하고 동시에 모니터링 할수 있습니다. 또한, 고감도 성능을 통해 Cdc42, Rac1 그리고 Ras small GTPase 단백질의 기능을 단일 수지상 돌기의 구조적 가소성 현상과 관련하여 해석 있었습니다. 이와 더불어 자유롭게 행동하는 생쥐의 뇌에서 다양한 세포 Ras 단백질의 활성을 최초로 관찰 하였습니다. 개발한 바이오센서는 생명체의 복잡한 신호 네트워크 상의 단일 단백질 기능을 시공간적으로 구획화 있었으며, 다양한 생명현상과 small GTPase 단백질 기능을 관련짓는 연구에 기여 것이라 기대 합니다.


2. 질문

   1) 개발한 센서가 동일한 small GTPase 단백질에 대해 기존 생화학적적 분석법과 비교하여 정량, 정성적 차이를 갖는지

       정확성 특이성 검증.

   2) 단일세포에서 동시에 여러 종류의 small GTPase 단백질을 서로 다른 파장으로(green or red) 관찰 가능한가.

   3) 적색계열 바이오센서 개발을 통해 청색광유전학(488nm) 기술과 접목될 유용성 확인.

   4) 살아있는 동물모델의 두꺼운 조직막을 통해 타겟 단백질의 활성을 관찰 있는 고감도 버전 개량.


3. 발견

   small GTPase 또는 다양한 세포내 단백질 활성 관찰을 위한 기존 바이오센서는 가지 형광 단백질을 사용하는FRET(Foster Resonance Energy Transfer) 이라는 기술에 대부분 국한되었습니다. 연구에서는 기존 기술과 달리 단일 형광을 이용한 개발로 다양한 장점을 확인 있었습니다. 특히 청색광유전학(optogenetics) 같이 특정 파장 (488nm) 활용하는 기술과 함께 용이하게 사용 있어 세포 이동과 같이 시공간적 구획화가 필요한 연구에 새로운 접근법을 제시 있었습니다. 개발과정에서 알게 pico수준의 예민한 감도 또한 두꺼운 조직막을 같는 동물모델 연구에 있어 유용함을 확인 있었습니다. 이외에도 녹색, 적색으로 센서를 개량 함으로써 단일세포에서 다수의 small GTPase 단백질 활성을 직접 비교분석 있었습니다. 특히 세포 마다 가지는 다양한 양상으로 야기 되는 실험적 오차를 극복 있고, 보다 세밀한 타이밍에서 단백질간의 상호작용을 비교 있어 신뢰성 높은 결과를 유도 있다고 기대 합니다. 또한, 고감도 성능을 통해 Cdc42, Rac1 그리고 Ras small GTPase 단백질의 기능을 단일 수지상 돌기의 구조적 가소성 현상과 관련하여 해석 있었습니다. 이와 더불어 자유롭게 행동하는 생쥐의 뇌에서 마이크로 크기의 공간에서 일어나는 Ras 단백질의 활성을 최초로 관찰 있었습니다. 종합하여, 개발한 바이오센서는 생명체의 복잡한 신호 네트워크 상의 단일 단백질 기능을 시공간적으로 구획화 있었으며, 다양한 생명현상과 small GTPase 단백질 기능을 관련 짓는 연구에 기여 것이라 기대 합니다.


4. 후속

   고감도 동물모 적용 가능성을 토대로 암세포전이연구, 신경세포발달 뇌신경회로 연구에 적용 기대. 기타 small GTPase 단백질 기능 질환 관련 연구그룹의 높은 활용 기대.


5. 소감

   새로운 기술은 기존 기술과의 엄밀한 비교를 요구합니다. 매번 기존 기술들과 비교 실험을 병행 해야 했던 점이 수고스러웠습니다. 기술이 가지는 장점을 보다 직관적으로 증명하기 위해 다양한 어플리케이션 실험을 시도하고 실패하며 힘들기도 했지만, 기존 기술보다 월등한 성능들을 순간 확인 있어 새로운 기술 개발에 한걸음씩 다가서는 희망을 가질 있었습니다. 또한, 소속 연구실에서 처음 시도 분야의 기술임에도 다양한 난관을 극복하고 도전했다는 점에서 새로운 연구주제에 대한 자신감을 얻는 계기가 되었습니다.

앞으로 많은 연구자들이 널리 이용 있는 생명과학분야의 유용한 분석기술이 되기를 희망합니다.


6. 기타

   물심양면 응원해주신 허원도 지도 교수님, 지칠 기쁠 함께 랩원 모두에게 감사 드립니다. 그리고 훌륭하게 연구를 마무리 있도록 Too Much John소리 해주신 이상규 박사님께 감사드립니다


  1. 정지혜(시스템 및 합성생물학 연구실, 조병관 교수님)

    ▷인터뷰 1. 논문 내용과 의미를 설명해 주세요. 단감의 경우 실제로 수확 후, 2주 후부터 연화가(물러짐) 진행되어 1달이 지나면 대부분의 단감이 연화되어 먹을 수 없습니다. 이렇듯 단감이 상품성을 가질 수 있는 기간은 한정적 ...
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  2. 유다영(동물세포공학 연구실, 이균민 교수님)

    ▷인터뷰 1. 논문 내용과 의미를 설명해 주세요. 현재 mammalian 세포에서 생산되는 단백질 의약품의 70%는 Chinese hamster ovary (CHO) 세포를 이용합니다. Glutamine synthetase (GS) / Methionine sulfoximine (MSX) 시스템은 CH...
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  3. 신정환(시스템신경과학 연구실, 정민환 교수님)

      ▷인터뷰 1. 논문 내용과 의미를 설명해 주세요. 기저핵은 신경계에서 대표적으로 강화학습과 수의적인 운동에 중요한 부위로 알려져 있습니다. 강화학습이란 예측한 기대치 (Expected value)와 ...
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  4. 송요셉(시스템 및 합성 생물학 연구실, 조병관 교수님)

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  5. 변현종(카이스트 부설 한국과학영재학교 미생물공학실, 안정훈 교수님) - 카이스트 생명과학과 학부생

     ▷인터뷰 1. 논문 내용과 의미를 설명해 주세요. 타입 I 분비 시스템(T1SS) 중 “폴리펩타이드를 수송하는 ABC 수송체”들의 단백질 분비 특성에 관해 연구한 논문입니다. 우리는 Pseudomonas fluorescens 박테리아가 보유한 ABC 수...
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  6. 이민지(바이오이미징/광유전학 실험실, 허원도 교수님)

    ▷인터뷰 1. 논문 내용과 의미를 설명해 주세요. 세포는 외부 환경으로부터 오는 변화를 수용체를 통해서 인식하고, 그 신호를 세포 내부로 전달하는데, 이를 통해서 세포 내에서 여러 기능들이 조절됩니다. 이러한 수용체 중 TGF-...
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  7. 정선혜(세포분열분화발생 실험실, 임대식 교수님)

    ▷인터뷰 1. 논문 내용과 의미를 설명해 주세요. Non-Alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD, 비알콜성지방간)/ Non-Alcoholic Steatohepatitis (NASH, 비알콜성지방간염)은 이름 그대로 알코올섭취와 상관없이 생기...
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  8. 서호규(크로마틴 연구실, 이대엽 교수님)

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  9. 서호규(크로마틴 연구실, 이대엽 교수님)

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  10. 박세근, 정용철, 김대건(행동유전학 실험실, 김대수 교수님)

    ▷인터뷰 1. 논문 내용과 의미를 설명해 주세요. 사람과 동물은 생존을 위한 먹이나 유용한 자원을 획득하기 위해 호기심을 갖고 다양한 사물을 탐색한다. 동물이 유용한 자원 혹은 먹이를 확보하려는 것은 생존을 위한 강력한 욕구이다. 인...
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  11. 김태묵(크로마틴 연구실, 이대엽 교수님)

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    1. 논문 내용과 의미를 설명해 주세요. 뇌가 정상적으로 기능하기 위해선 다양한 molecular process를 통해 neuronal synapse가 잘 발달 되어야 합니다. 특히나, presynapse와 postsynapse 사이의 adhesive contact은 매우 중요한 단계이며 이 ...
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    ▷인터뷰 1. 논문 내용과 의미를 설명해 주세요. 현재 사용되고 있는 대부분의 질병 치료제들은 항체에 기반하고 있습니다. 그러나 이러한 항체 기반의 치료들은 제작이 어려우며 제조비용도 매우 높습니다. 그래서 이러한 항체들을 대신할...
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